2.1　目的蛋白的表達　SDS2PAGE電泳可見,pBEX2PPM1A2His經(jīng)IPTG誘導2、4h后在大腸桿菌中均有表達,4h時獲得量zui大,空菌誘導4h僅有較弱條帶。且PPM1A的產(chǎn)量隨IPTG的濃度加大變化不大.
2.2　目的蛋白的純化和復性　誘導后的菌體處理后經(jīng)超速離心,SDS2PAGE電泳發(fā)現(xiàn)大部分目的蛋白存在于沉淀中,主要以包涵體形式存在。用Ni2NTA純化試劑盒處理所得的目的蛋白純度達90%,質(zhì)量濃度為2.45mg/mL,復性后目的蛋白質(zhì)量濃度為1.15mg/mL。
2.3　目的蛋白的Western2blot鑒定　空菌組無明顯條帶,誘導菌組可見較強條帶,提示IPTG誘導后所得的蛋白為目的蛋白。
2.4　多克隆抗體滴度檢測　純化的PPM1A重組蛋白0.1g/mL每孔100L包被,ELISA法測得的抗體滴度達到1∶100000。
2.5　多克隆抗體的特異性檢測　PPM1A多克隆抗體1∶800作為*抗體,用Envision免疫組化法檢測肝癌組織Edmondson病理分級Ⅰ級中PPM1A的表達,同時用PPM1A鼠單克隆抗體和正常小鼠血清分別為陽性對照和陰性對照為*抗體檢測,結(jié)果可見PPM1A多克隆抗體組和PPM1A鼠單克隆抗體陽性對照組的肝細胞胞核和胞漿明顯陽性表達,而正常小鼠血清組則無著色;另也用免疫熒光法檢測HepG2細胞中PPM1A的表達,PPM1A多克隆抗體1∶50組細胞的胞核陽性著色,正常小鼠血清組則未見明顯熒光。
3　討論
PPM1A蛋白磷酸酶1A（以前2C）（PP2CA;MGC9201;PP2C2ALPHA是一種抑癌基因,定位于染色體14q23.1,47604bp,屬于絲/蘇蛋白磷酸酶的PP2C家族,為一常見的鎂或錳離子依賴的去磷酸化酶,定位于胞漿和核,使MAP激酶和MAPK激酶去磷酸化而起負調(diào)節(jié)作用;能使細胞周期蛋白依賴的激酶去磷酸化,參與細胞周期的調(diào)控;可抑制環(huán)境應激反應誘導的p38和JNK激酶級聯(lián)作用;其過量表達可激活抑癌基因TP53/p53的表達,導致細胞周期停滯于G/M期和引起細胞凋亡,從而可能參與腫瘤的發(fā)生機制調(diào)節(jié)。
TGF2家族成員廣泛存在于從果蠅到人類的多種生物的各種組織中,控制多種正常細胞的發(fā)育過程,參與一些癌癥、自身免疫疾病和纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展。TGF2信號通路的應答中一個關(guān)鍵的步驟就是Smad2被TGF2受體II磷酸化后與Smad3,Smad4形成復合體,移位細胞核中,與序列特異的DNA結(jié)合蛋白CRB/P300等結(jié)合,啟動TGF2通路,激活特定的靶基因。Xu等人研究認為Smad2的磷酸化與去磷酸化對TGF2信號通路的調(diào)節(jié)起重要作用,而近期發(fā)現(xiàn)PPM1A就是那種特異的去磷酸化酶,促進核中Smads的去磷酸而轉(zhuǎn)移出核,PPM1A的異常表達會消除TGF2誘導的抗增生核轉(zhuǎn)錄反應,但是刪除PPM1A會使哺乳動物細胞中的TGF2號途徑活性增高。資料顯示TGF2/Smads通路是肝臟細胞生長的一個重要調(diào)節(jié)因子,參與肝細胞的生長、分化、黏附、轉(zhuǎn)移、細胞外基質(zhì)的形成及免疫調(diào)節(jié)等,肝癌組織中磷酸化Smad2核聚集可與肝臟腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。故而,進一步深入研究肝組織中PPM1A的功能有深遠意義。
該試驗中,我們利用制備的PPM1A鼠多克隆抗體,采用免疫組化法檢測肝癌組織中PPM1A的表達,顯示其結(jié)果與用PPM1A單克隆抗體檢測相似,用免疫熒光法檢測了HepG2細胞中的PPM1A的表達主要定位于胞核,與文獻報道的結(jié)果一致示了PPM1A鼠多克隆抗體能特異地檢測肝組織中PPM1A的表達,為下一步深入研究肝細胞中PPM1A的功能以及與TGF信號通路的對肝癌發(fā)生的影響等研究打下了基礎,為尋找新的治療策略提供了參考資料。